Svipstýring (allostery) - lykilhugtak í kerfislíffræði (System biology)
Ekki hafið
Við höfum áhuga fyrir því að kanna hvort litlar lífrænar stýrisameindir og/eða málmjónir hafi áhrif á ensímið alkalískan fosfatasa.  Þetta ensím hefur nokkuð óvisst hlutverk, en bygging þess hefur verið greind úr allmörgum lífverum.  Í manni eru fjögur afbrigði með vefjaháða útbreiðslu, en í þorski er aðeins ein útgáfa.  Örverur innihalda a.m.k. þrjú mismunandi afbrigði eftir tegundum.  Greiningar á kristallabyggingu hafa leitt líkur að því, að sum afbrigin í manni séu undir stýringu frá amínósýrum, þar sem tilteknar amínósýrur hafa mismunandi áhrif á virknina.  Sömuleiðis hafa fundist bindiset fyrir tvígildar málmjónir í ensími úr kuldakærri örveru, sem bendir til hlutverks við virknistýringu.  Verkefnið snýst um að meta áhrif slíkra efna á tvo alkalíska fosfatasa sem við höfum yfir að ráða, og meta hvort alkalískur fosfatasi geti talist svipstýrt (allosterískt) ensím.  Annar fosfatasinn er úr þorski en hinn úr kuldakærri Vibrio örveru.
Í upphafi var hugtakið svipstýring (allostery), af sumum kallað stýrilnæmi, tengt mismun í bygginu eða lögun smásameinda sem gátu haft áhrif á virkni tiltekins ensíms/próteins.  Erlenda nafnið er einmitt sett saman úr grísku orðunum "allos" (annar) og "stereos" (stíf þrívíddarlögun), sem vísaði til þess að bindistaðir smásameindanna þurftu að hafa ólíka lögun, ásamt þeim sjálfum.  Svipstýring varð fljótt nátengd hugtakinu samvirkni (cooperativity) sem jafnframt fól í sér fyrstu útvíkun á hugmyndum um samskipti smásameinda við prótein.  Nú var vísað til breytinga í lögun/byggingu/stellingu/svipmóti eininga í margliða (oligomeric) próteinum, þar sem fjórða stigs byggingu þeirra var stýrt, og var breytt milli tveggja ástanda með tengingu smásameinda í sértæka bindistaði.  Nýlega hefur þessi skilgreining verið víkkuð út enn frekar (Kuriyan J & Eisenberg D (2007) The origin of protein interactions and allostery in colocalization. Nature 450, 983-990).  Nú vísar hún til breytinga í svipmóti próteins, hvort sem um er að ræða fjórða stigs byggingu (hjá margliða próteinum), eða þriðja stigs byggingu (hjá einliða próteinum), eða hvort tveggja.  Einnig getur áhrifavaldurinn nú verið annað hvort smásameind eða annað prótein.  Enn frekari útvíkkun felur í sér þann möguleika, að ekki sé um staða (static) breytingu milli tveggja ástanda að ræða, heldur sé um breytingu í kvikum hreyfanleika (dynamic flexibility).  Þannig nær hugtakið svipstýring yfir stýringu á flæði efna gegnum efnaskiptaferla, auk þess að lýsa viðbrögum  frumunnar við utanfrumuboðefnum og öðru áreiti.  Svipmynd/svipmót próteina á hverjum tíma endurspeglar svipmynd af frumunni á því augnarbili. (080207-BÁsg)

Notkun rafeindaspunamælinga til að afla upplýsinga um hreyfingar í próteinum
Hófst 2005
Verkefnið felur í sér að setja cystein aminósýruna inn á mismunandi stöðum í prótein og þannig innfæra spunamerki á þekktum stöðum í byggingu próteinsins. Síðan er hægt að breyta aðstæðum og/eða öðrum amínósýrum og rannsak tengsl hreygina og eðlisþátta svo sem virkni og stöðugleika. alkalískum fosfatasa úr Vibrio sp. er fyrirhuguð með þróunarfræðilegum aðferðum (e. directed evolution) og greining á þeim. Eiginleikinn sem valið yrði fyrir er hitaþolni. Vibrio AP er einstaklega hentugt ensím að því leiti, því þolir ekki hitastig yfir herbergishita. Leitast yrði við að skilja grundvöll kuldaðlögunar á sameindastigi, en nú út frá nýstárlegum afbrigðum, sem ekki hafa enn orðið til í náttúrunni og verða líklega aldrei til þar.

Gerð nýrra ensíma með þróunaraðferðum.
Ekki hafið
Frekari gerð afbrigða af alkalískum fosfatasa úr Vibrio sp. er fyrirhuguð með þróunarfræðilegum aðferðum (e. directed evolution) og greining á þeim. Eiginleikinn sem valið yrði fyrir er hitaþolni. Vibrio AP er einstaklega hentugt ensím að því leiti, því þolir ekki hitastig yfir herbergishita. Leitast yrði við að skilja grundvöll kuldaðlögunar á sameindastigi, en nú út frá nýstárlegum afbrigðum, sem ekki hafa enn orðið til í náttúrunni og verða líklega aldrei til þar.

Einþáttun og ofurtjáning alkalísks fosfatasa úr þorski.
Hófst 2007
Miklar upplýsingar liggja nú fyrir um eiginleika og byggingu þessa ensíms. Okkur langar að finna gen alkalísks fosfatasa úr þorski, og ofurtjá ensímið til að gera sambærilegar stökkbreytingar á honum og lýst er fyrir Vibrio AP annar staðar á síðunni. Höfum nú þegar útbúið genasafn, en tókst ekki að finna genið í eldri forathugnum 1996. Nú er öll amínósýruröðin þekkt og því liggur beinna við að smíða góða vísa/þreifara.

Gerð afbrigða af alkalískum fosfatasa úr Vibrio sp. með markvissum stökkbreytingum,
Hófst 2003
Með markvissum stökkbreytingum, og greining á þeim, er leitast við að skilja grundvöll kuldaðlögunar á sameindastigi. Hafnar eru tilraunir á (i) virkum amínósýrum hvarfstöð; og (ii) innsetningu nýrra tvísúlfíðtengja. Einnig er áætlað að kanna (iii) hlutverk lykkjusvæða; (iv) hlutverk prólín og glýsín hópa; og (v) hlutverk aspartik sýru og glútamik sýru á yfirborðinu

Gudjónsdóttir & Ásgeirsson, B. (2008)  Effects of replacing active site residues in a cold-active alkaline phosphatase with those found in its mesophilic counterpart from E. coli. FEBS J. 275, 117-127.

Guðjónsdóttir, K., Andrésson, Ó.S. & Ásgeirsson, B. (2007)  Áhrif stökkbreytinga í hvarfstöð kuldavirks alkalísks fosfatasa.  RAUST, tímarit um raunvísindi og stærðfræði.   4 (2),89-96.

Hraðafastar í hvarfgangi serín próteinasa.
Hófst 2003
Vitað er að kuldavirkir serín próteinasar úr meltingarvegi þorsks hafa hvötunarvirkni sem er margföld á við hvötunarvirkni sambærilegra ensíma í spendýrum. Hér er átt við heildarhvötunarstuðulinn kcat, sem er samsettur úr öllum hraðaföstum fyrir einstök skref í hvarfgangi ensímanna. Við höfum hafið mælingar á einstökum hraðaföstum til að leiða í ljós hvar mesti munurinn er í hvarfgangi kuldavirku ensímanna: k1 (tenging hvarfefnis); k-1 (losun hvarfefnis án hvarfs); k2 (asylering ensíms); eða k3 (afasylering og losun myndefnis). Aðferðafræðin hefur verið reynd með góðum árangri á trypsini úr þorski.

Ásgeirsson, B. & Cekan, P. (2006) Microscopic rate-constants for substrate binding and acylation in cold-adaptation of trypsin I from Atlantic cod.  FEBS Lett. 580, 4639-4644.

Cross-linking of a cold-adapted alkaline phosphatase increases thermal stability while reducing kinetic activity
Hófst 2000
Megintilgátan um aðlögun ensíma að lágu hitastigi er sú, að komið sé í veg fyrir að sameindin missi innri hreyfanleika og "frjósi". Í tilgátunni felst sú hugmynd, að tiltekinn hreyfanleiki sé nauðsynlegur fylgifiskur hvötunarferilsins. Vitað er að stöðugleiki kuldavirkra ensíma er minni en hitaþolinna afbrigða, og má rekja það til þess að losað hafi verið um innri samloðunarkrafta. Því má spyrja hvað gerist séu sett víxltengi inn í peptíðkeðju kuldavirks próteins. Væntingarnar eru þær að stöðugleikinn gagnvart hitun aukist, en hvötunargetan minnki jafnframt. Athuganir okkar á alkalískan fosafatsa úr Vibrio örveru eftir víxltengingu með glutaraldehýði (og fleiri efnum) benda til að þessi tilgáta standist. Þessar rannsóknir væri áhugavert að auka, eftir mjög erfitt byrjunarskeið við þróun aðferðafræðinnar á tilraunastofu okkar.

Ásgeirsson, B., Adalbjörnsson, B.V. & Gylfason, G.A. (2007)  Engineered disulfide-bonds increase active-site local stability and reduce catalytic activity of a cold-adapted alkaline phosphatase. Biochim. Biophys. Acta 1774, 679-687.

Einþáttun og ofurtjáning alkalísks fosfatasa úr Vibrio sjávarörveru. Endurbætur.
Hófst 2002
Þótt framleiðsla á alkalískum fosfatasa úr Vibrio sé þegar hafin af plasmíðinu pBluescript í hýslinum Vibrio , er framleiðslumagnið lítið. Gen próteinsins er nú þegar komið inní ofurtjáningarvektorinn pBAD, en próteinið sem framleiðist er óvirkt. Verkefnið fjallar um að laga genainnskotið til, þannig að tilteknar forraðir fari út, og engar aukaraðir hangi við genið nema fyrir Hisx6 hala sem auðveldar hreinsun til muna.

Autolysis of two chymotrypsin variants from Atlantic cod (Gadus morhua) and the effect on stability after exposure to high temperatures
Hófst 1997
Próteinasar klippa skörð í önnur prótein fái þeir tækifæri til þess. Þetta á einnig við um aðra próteinasa; jafnvel sömu gerðar. Viðkvæmustu svæðin í fjölpeptíðkeðjunni eru svokallaðar lykkjur, sem liggja þétt upp á yfirborði hnattlaga próteina, þar sem fjölpeptíðkeðjan tekur beygjur við svipmótun keðjunnar í þrívíddarform sitt. Þessi lykkjusvæði eru oftast hreyfanlegasti hluti próteina og taka gjarnarn virkan þátt í störfum þeirra. Beita má takmörðuðu próteinasarofi til að fá upplýsingar um hreyfanleika svæða í próteina. Við höfum áhuga á að nýta þessa tækni meira en kostur hefur verið hingað til. Haustið 2004 er von á massagreini á Lífefnafræðistofu Raunvísindastofnunar, og verður greining niðurbrotsafurða þá mun auðveldari en hingað til. Sjálfmelta chymotrypsins úr þorski hefur verið rannsökuð með hliðsjón af sams konar atburðum í chymotrypsini úr nautgripum. Tæknilega krefjandi. Unnið sem sérverkefni.

Affinity matrix suitable for leucine aminopeptidase from Atlantic cod and properties of the enzyme
Hófst 1999
Upphaflegi tilgangurinn var að þróa aðferð til að losa þrálátan mengunarþátt úr sýnum við hreinsun á alkalískum fosfatasa þorsks. Komið hafði í ljós að hann er leusín amínópeptídasi (LAP). LAP er í sjálfum sér mjög áhugavert ensím; m.a. má nýta það í iðnaði við að losa beisk peptíð úr matvörum og drykkjum. Gerð sértækrar skilju fyrir LAP reyndist erfiðara verkefni en búist var við, og hafa þó þrír nemendur spreytt sig á þessu i sérverkefnum.

Ræktun og tjáning alkalísks fosfatasa úr Vibrio við mismunandi hitastig og í mismunandi ræktunaræti.
Hófst 2001
Verkefnið miðar að því að besta ræktun til framleiðslu kuldavirks ensíms í mismunandi E. coli stofnum (JC9223; E15; LMG194; Top10; BL21) við lág hitastig, þannig að ensímið sé losað vel út út frumunum inn í millihimnurýmið (e. periplasmic space). Miðað er við að nota phoA- stofna sem framleiða ekki eigin fosfatasa. Mismunandi plasmíð eru prófuð og mismunandi örvun á tjáningu beitt, t.d. pBluescript (lágt fosfat); pBluescript (IPTG); pBAD (arabínósi).

Trypsin-líkur kollagenasi úr meltingarvef þorsks.
Hófst 2000
Í safni serín próteinasa sem einangraðir voru á grundvelli chymotrypsinvirkni af vatnfælinni skilju reyndist vera ensím í afar litlu magni með sértæka trypsin-líka virkni. Ensímið klauf Cbz-Gly-Pro-Arg-p-nítróanílíð, en ekki Bz-Arg-p-nítroanílíð. Markmiðið er að raðgreina þetta ensím og kanna staðsetningu þess í fjölskyldutré serín próteinasa nánar. Unnið sem sérverkefni.

Virkur þáttur í kálfasermi sem hindrar sýkingu með visnuveiru.
Hófst 2000
Unnið í samstarfi við Dr. Völu Andrésdóttur (Keldum). Okkar þáttur er að reyna að hreinsa og bera kennsl á þennan þátt. Svo virðist sem um prótein sá að ræða, en með mjög stöðuga byggingu. Hugsanlega skiptit þrívíddarbygging þess ekki máli, heldur sykrukeðjur sem hanga á því. Massagreining á virkum sýnum hafa gefið vísbendingar um tvö þekkt prótein úr gagnabönkum, en staðfesting hefur ekki fengist enn.

Substrate specificity of elastase C from Atlantic cod (Gadus morhua), a chymotrypsin-like serine proteinase.
Hófst 1999
Þetta ensím er eitt af þeim sem finnast í fremur litlu magni í meltingarfærum þorsks. Amínósýruröðin líkist mest bandvefskljúfum úr elastasa fjölskyldunni, en ensímið virðist ekki hafa neina virkni gegn elastíni. Markmið verkefnisins var að skilgreina betur þessa mótsögn, m.a. kanna hvort um kollgenasa gæti verið að ræða. Unnið sem sérverkefni.

Nýsmíði hindra fyrir serín próteinasa.
Hófst 1994
Unnið í samstarfi við Próf. Jón K.F. Geirsson. Markmið verkefnisins er að finna p-nítróanílíð afleiður cinnamik sýru og fenylalaníns sem hvarfast við serín próteinasa (chymotrypsin, subtilísin, próteinasa K) á óafturkræfan hátt. Unnið sem mörg sérverkefni.

(Síðasta uppfærsla 1. janúar 2008)